新抗原鉴定策略使难治性实体肿瘤的个性化免

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今天向大家分享的是由南京大医院肿瘤中心刘宝瑞教授团队的陈仿军博士于年在JournalofClinicalInvestigation(IF=12.28)发表的关于肿瘤新抗原个体化免疫治疗的文章《Neoantigenidentificationstrategiesenablepersonalizedimmunotherapyinrefractorysolidtumors》。文章建立了2种高效的新抗原筛选模式，结合靶向测序和构建共享新抗原肽库，并成功地应用于难治性晚期实体肿瘤患者的个性化免疫治疗，给多种恶性实体肿瘤的精确免疫治疗提供了道路。

背景：

基因组和生物信息学技术的进步使我们能够解剖由肿瘤特异性突变编码的个性化新抗原的免疫反应。然而，及时有效地识别新抗原仍然是基于个性化新抗原的癌症免疫治疗的主要障碍。

方法：

在难治性实体肿瘤患者中进行临床分级靶向测序，并重新合成具有高变异等位基因频率和预测高HLA结合亲和力的突变肽（b）建立实体肿瘤的共享新抗原肽库，并将患者的热点突变与新抗原肽库相匹配,使用肽库来源的抗原进行体外筛选。

结果：

靶向测序引导的从头合成模型的新抗原鉴定

1.首先选择等位基因频率（AF）2%的体细胞突变鉴预测与患者的HLA-I和Ⅱ类结合T细胞表位；2.采用NetMHC3.4/NetMHC4.0和NetMHCpan3.0用于预测MHCI类限制性T细胞表位，NetMHCII2.2用于预测MHCII类限制性T细胞表位；3.根据以下标准对预测的肽段进行排序，a.IC50(50nM)或者Rank%b.高AFc.可结合2个或者2个以上的HLA分子的肽d.根据不同算法对多肽进行预测，鉴定预先存在的T细胞对优先突变肽的反应特异性，每个患者的PBMCs在IL-2（白细胞介素-2）存在下用肽段刺激10天，使用酶联免疫斑点法（ELISPOT）检测效应细胞因子IFN-γ的分泌，用流式细胞法检测T细胞激活标志4-1BB的表达，这些方法可以提供关于抗原特异性T细胞反应的补充和非冗余信息。

在两例转移性胸腺癌患者（ID：A、A）的肿瘤样本中进行新抗原的鉴定：对于转移性胸腺癌患者A，合成了受自体MHCI类和II类同种型限制的前9位预测结合肽，并通过体外自体PBMCs进行识别测试，ELISPOT实验和流式细胞法分析一致表明，A*限制的CD8+T细胞表位(TP53-V25G-1,RGRAMAIYK)和DRB1*限制的CD4+T细胞表位(DIS3L2-IV,DIS3L2-IV,MVMGVLKQAFDVLVL)可诱导显著的肽特异性T细胞应答（如图1）。

图1转移性胰腺癌A患者个体化新抗原的鉴定

对于转移性胸腺癌患者A，选择AF10%且具有良好结合亲和力的三个HLA-A*限制性T细胞表位，同时从共享新表位肽库中加入9个HLA-A*02限制性不相关突变肽作为对照，以评估T细胞特异性抗原水平。结果表明，突变的CDC73-QE-1（NIFILESV）刺激了大量的IFN-γ斑点和明显的CD8+4-1BBT细胞，而对照组没有明显反应。随后，用T2细胞株评估突变型CDC73（CDC73-MT）和相应野生型（CDC73-WT）肽与HLA-A*的结合亲和力。在浓度为6.25μM至50μM的情况下，CDC73-MT肽（NIFAILQSV）与HLA-A*分子具有较强的结合力。值得注意的是，CDC73-WT肽在较高浓度的μM时也表现出较强的结合亲和力。在0.01nm到0nm的浓度范围内，进一步评估了自体T细胞对突变型和相应野生型CDC73肽的反应性。患者的T细胞识别了在1.0nM的突变CDC73-QE肽段脉冲的T2细胞，但用nM的WT肽段进行脉冲处理后，无法识别细胞(图2E)。尽管WT肽对HLA-A*具有中等亲和力，但未能诱导自体T细胞的IFN-γ分泌，表明CDC73肽中的突变氨基酸可能主要影响T细胞受体的接触残基。

图2转移性胸腺瘤A患者新抗原的特性和免疫原性测试

此外，在其他2例晚期胃癌患者（ID：A，A）的新抗原鉴定是基于在肿瘤组织和血浆ctDNA中都存在体细胞突变。将AF大于2%的非同义和移码突变用于预测与每个患者HLA-A、HLA-B和HLA-C等位基因结合的T细胞表位，其结合亲和力（%Rank）小于2.0。最终优先选择突变肽用于免疫原性研究。在患者A中，9个优先肽中的一个新表位（CYP2A6-NY，KRYCFGEGL）被预测与HLA-B*和HLA-C*结合，由自体外周血淋巴细胞识别，并通过IFN-γ和4-1BB的表达水平（图3，A和B）。在患者A中，对优先选择的12种候选突变肽进行体外重复刺激PBMC，但未检测到肽特异性反应。

图3晚期胃癌患者A中个性化新抗原的鉴定

(A)用8个候选突变肽刺激自体PBMCs10天，然后进行IFN-γELISPOT检测，以评估T细胞特异性抗原反应。

靶向测序评估突变和新抗原鉴定的潜力

(B)用FACS检测4-1BB对CD8+T细胞的上调，以PHA为阳性对照，无肽刺激为阴性对照，数据代表3个独立实验。

一个大型的靶向测序小组有可能识别多个晚期实体肿瘤患者的突变和新抗原。在17例晚期实体肿瘤患者中进行了个癌症相关基因的大型临床分级靶向测序小组，并通过PCR-SBT确定了每个患者的HLA分型数据，中位数为35，发现体细胞错义突变（范围9~73）（图4A）。针对每个患者的限制性HLAI类等位基因（HLA-A、HLA-B和HLA-C）的非同义单核苷酸变异突变，确定候选新抗原表位。用NetMHCpan3.0程序鉴定了55个预测的HLAI类限制性新抗原（范围8~），其%Rank小于2。在上述候选表位中，强结合的数量（%Rank0.5）从0到43，中位数为19。此外，弱结合的数量（0.5%%Rank2）在8到98之间，中位数为44（图4B）。在体外进行新抗原筛查的4例患者在17例患者中表现出中度甚至更多的突变（图4）。显然，一个大型的靶向测序小组有可能识别多个晚期实体肿瘤患者的突变和新抗原。

图例晚期实体瘤患者体细胞突变和预测表位的频率

(A)对17例晚期实体癌患者进行了包含个癌症相关基因的大型临床级靶向测序

(B)预测每个患者限制HLAI类等位基因(HLA-A、HLA-B和HLA-C)的非同义单核苷酸变异的新抗原表位的频率“+”表示筛选的肿瘤样本中检测到新抗原特异性T细胞反应;“-”表示筛选出的1个未检测到新抗原特异性T细胞反应。

共享新抗原肽库的构建

利用TCGA和COSMIC数据库对胃癌、大肠癌、食管鳞癌、肝癌、肺腺癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌等9种人类恶性实体肿瘤中挖掘高频突变基因，并通过计算机分析计算各基因热点突变频率。

上述肿瘤在COSMIC数据库中，共有21个突变基因的频率大于10%，对TCGA数据库的个测序样本中进行了进一步评估。其次，观察到21个复发突变基因中的大多数，其中错义突变分散在整个基因中，不能作为理想的共享抗原靶点。然而，KRAS、TP53、CTNNB1、EGFR、BRAF、PIK3CA和GNAS中存在29个理想热点突变（表1），这些突变被归类为癌症驱动基因。因此，选择29个热点突变作为构建共享新抗原肽库，该库覆盖了TCGA数据库中9.49%-89.5%的癌症患者，中位覆盖率为23.04%（图5A）。

图5所选29个热点突变和共享新抗原肽库（TCGA）覆盖的患者比例

（A）TCGA数据库中所选29个热点地区的癌症患者比例（9.49%-89.5%）

（B）共享新抗原肽库覆盖TCGA数据库的患者比例（5.11%-83.8%）

表位预测分析的结果以NetMHC4.0/NetMHC3.4(ICnm)等为主要工具，并通过其他程序的支持选择44条共享的新表位肽用于肽合成（表2）。虽然少数热点突变被预测与所选的HLAI类等位基因缺乏结合亲和力，但共享新抗原库仍可覆盖9种常见实体肿瘤患者中的5.11%-83.8%，中位覆盖率为11.2%（图5B）。

表1常见实体肿瘤热点突变的变异频率（TCGA）

表2常见实体肿瘤共享新抗原肽库的构建

共享新抗原肽库引导新抗原鉴定

在这些患者中，通过-ELISPOT和流式细胞仪分析IFN-γ，对13名携带相应热点突变和与共享的新抗原肽库匹配的常见HLA-A等位基因的患者进行免疫原性新抗原鉴定。在6例患者中鉴定了基于新抗原肽库的自体PBMCs识别的免疫原性新抗原。

小结:

1.首先使用从头合成模式的4例患者中有3例的（ID：

A、A、A）免疫源性新表位被自体T细胞识别，而使用共享新抗原肽库的13例患者中有6例被自体T细胞识别。

转移性胸腺瘤患者在治疗后29个月后获得了完整和持久的反应。

在另一例转移性胰腺癌患者中观察到免疫相关的部分反应。

其余4例患者实现了疾病的长期稳定，中位无进展生存期为8.6个月。

2.个体化免疫原性新表位的鉴定是临床研究转化为基于新抗原的肿瘤免疫治疗的主要障碍。在本研究中，建立了2种不同的新抗原筛选模式，并成功地应用于难治性晚期实体肿瘤患者的个性化免疫治疗。

3.①与以往研究相比,本研究中发现的新抗原数量虽然略低，但候选肽的数量明显减少，在高通量测序后，运用改良后的抗原预测算法和灵敏的体外筛选方式，大大提高了新抗原筛选效率；②建立共享的新抗原肽库，共享的新抗原肽库代表了大量的实体肿瘤患者，当患者检测到热点突变后与现成肽库来源的抗原相匹配，能够及时、有效地识别新抗原，从而显著缩短新抗原鉴定的时长。

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